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淺析高效液相色譜柱峰形拖尾的原因

更新時(shí)間:2021-10-19      點(diǎn)擊次數(shù):8631
  今天小編給大家講講高效液相色譜柱峰形拖尾的9個(gè)原因:
 
  1.色譜柱物理?yè)p壞
 
  色譜柱有物理?yè)p壞是造成峰形拖尾的根源,解決方法就是更換新柱。
 
  2.色譜柱內(nèi)填料污染
 
  流動(dòng)相和樣品中的雜質(zhì)是色譜柱主要污染源。
 
  流動(dòng)相所用的各種溶劑至少是分析純,盡量使用色譜純?cè)噭?br /> 
  流動(dòng)相所用的水要是超純水或全玻璃器皿雙蒸水。
 
  用前先用0.45um溶劑微孔過(guò)濾(器)過(guò)濾,除去可能存在的微粒。
 
  流動(dòng)相建議現(xiàn)用現(xiàn)配,對(duì)于含鹽的溶液尤其注意長(zhǎng)置會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌或出現(xiàn)沉淀。
 
  此外還得保證儲(chǔ)存流動(dòng)相的容器清潔。
 
  復(fù)雜樣品可選用0.45um溶劑微孔過(guò)濾(器)或樣品預(yù)處理柱對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,確保樣品中不含微粒雜質(zhì)。
 
  若樣品不便處理,要使用保護(hù)柱。
 
  柱內(nèi)填料污染時(shí),可將柱頭螺絲卸下,用專用工具挖出柱內(nèi)前段被污染填料,再以相同的填料重新填入,修復(fù)。
 
  或以能溶解污染物的流動(dòng)相按色譜柱使用的相反方向,沖洗色譜柱(約20至30倍柱體積,或視具體情況而定;另外,此時(shí)不能接檢測(cè)器),將污染物沖出色譜柱,再按色譜柱標(biāo)明的使用方向使用。
 
  3.色譜柱進(jìn)口處有異物
 
  當(dāng)斷定是柱進(jìn)口處有異物時(shí),可將柱頭螺絲卸下,取出濾帽并將其置于20%硝酸溶液中,用超聲波清洗約20分鐘,再置于超純水中,并用超聲波清洗約10分鐘,重新裝入色譜柱內(nèi)即可。
 
  4.樣品濃度過(guò)高致使柱超載
 
  樣品在柱上超載能引起峰展寬,拖尾(或伸舌)。
 
  適當(dāng)減小進(jìn)樣量或樣品濃度(需要時(shí),可提高檢測(cè)器靈敏度)直至峰形和保留時(shí)間不再改變,便可消除這種不良影響。
 
  減小進(jìn)樣量還能改善其分離度。正常情況下,樣品中每種化合物在150×4.6mm柱中進(jìn)樣量保持在3~50ug范圍內(nèi),不會(huì)引起明顯超載。
 
  5.樣品溶劑不對(duì)
 
  選擇合適的樣品溶劑,以排除不必要的干擾。要選用流動(dòng)相溶解樣品。
 
  6.柱外效應(yīng)
 
  柱外效應(yīng)(即進(jìn)樣閥、色譜柱及檢測(cè)器間的管路過(guò)長(zhǎng)、直徑過(guò)粗、管路接頭不匹配、有死體積)是影響色譜柱柱效的主要因素之一。
 
  所以在可能的條件下,色譜柱的兩端連接管路要盡可能短,連接管內(nèi)徑盡可能細(xì)小,切口務(wù)必平整光滑,盡可能的減小死體積,以防止因樣品擴(kuò)散造成不能反映色譜柱真實(shí)柱效等情況發(fā)生。
 
  7.緩沖不足或不合適
 
  在緩沖不好或離子強(qiáng)度過(guò)低的分離中,也會(huì)出現(xiàn)保留時(shí)間重現(xiàn)性差和峰形拖尾。增加緩沖濃度(與樣品大小相匹配)能改善此情況。
 
  8.硅醇基團(tuán)作用
 
  仔細(xì)分析色譜柱內(nèi)填料表面性質(zhì)可知:反相色譜柱填料的表面大約被鍵合相覆蓋了一半,其余的就是未被鍵合的硅醇基團(tuán)。
 
  所謂的保留是指樣品分子與鍵合相相互作用的結(jié)果。
 
  但是,酸性或堿性化合物與硅膠表面殘存的硅醇基團(tuán)或金屬雜質(zhì)之間相互作用而引起雙重保留機(jī)理,因此,發(fā)生了峰形拖尾。
 
  為了減小峰形拖尾,通??稍诹鲃?dòng)相加入25mM三乙胺(抑制劑)。三乙胺能與硅醇基團(tuán)發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用,從而降低或阻斷樣品分子與硅醇基團(tuán)的作用,以保證保留機(jī)理正常進(jìn)行,并大大緩解了峰形拖尾。使用長(zhǎng)鏈的硅醇基抑制劑,雖起效較慢,但持續(xù)力較三乙胺長(zhǎng)。
 
  因?yàn)橐种苿┓肿又谐税坊c硅醇基團(tuán)發(fā)生極性作用外,大分子中非極性部分與固定相也會(huì)發(fā)生反相作用而產(chǎn)生保留現(xiàn)象。如果將抑制劑加至樣品中,效果會(huì)顯著。
 
  9.色譜柱內(nèi)金屬污染
 
  柱內(nèi)金屬污染(Fe,Ni等)可引起某引些化合物峰形拖尾。金屬可由填料本身帶進(jìn),也可由腐蝕性流動(dòng)相緩慢溶解柱進(jìn)口的金屬濾片,隨流動(dòng)相沉積到柱填料中。
 
  例如C18柱填料被金屬污染后,造成酸性/堿性樣品拖尾,可用堿洗/酸洗后再鍵合的填料,得到的峰是尖銳且對(duì)稱的。

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